Entre las diferentes técnicas de análisis de muestras una de las más comunes y utilizadas es la cromatografía líquida. Se trata de una técnica con un proceso sencillo, pero sumamente importante para el control de calidad de medicamentos, alimentos, y otros sectores que requieren de la separación e identificación de los componentes de una muestra líquida.
Para esta Bitácora del Analista exploraremos sobre qué va la cromatografía líquida desde cero: Sus fundamentos, parámetros para tener en cuenta y muchos otros detalles cruciales para esta técnica analítica.
La cromatografía líquida en pocas palabras
Lo más importante para comprender la cromatografía líquida es entenderla como una técnica con la cual se separan los compuestos de una sustancia a través de dos fases principales: La fase móvil y la fase estacionaria. Cuando una mezcla es analizada por un cromatógrafo líquido los componentes de esta interactúan de maneras diferentes con cada fase.
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Siendo breves y directos, podemos resumir cada fase así:
La fase móvil es el líquido que se mueve por la columna, y puede tratarse de agua, metanol o cualquier otro solvente que dependerá de lo que necesites separar.
Por otra parte, la fase estacionaria es el material que se encuentra dentro de la columna que, claro está, no se mueve, por lo que a medida que la sustancia a separar pasa con el solvente, las moléculas interactúan según la afinidad con esta fase y se va produciendo la separación de la mezcla.
Por esto, mientras unos componentes se mueven con fluidez a través de la fase móvil, otros se adherirán en mayor o menor medida en la fase estacionaria, lo cual genera lentamente la separación de la mezcla durante el desplazamiento por el sistema.
La clave de todo está entonces en cómo las moléculas de la mezcla interactúan con la fase estacionaria y móvil. Es decir, cada compuesto tiene una velocidad diferente de desplazamiento según sus características químicas y esto permite separar la mezcla y posteriormente identificar cada molécula con ayuda del detector.
Un resumen muy general del funcionamiento de esta técnica se puede ver en este esquema:
La fase móvil es impulsada por las bombas y la muestra ingresa al sistema cromatográfico a través del automuestreador. Luego, la separación se da en la columna y posteriormente se identifican los componentes con los detectores.
Columnas según la ocasión
Es claro ahora que en la cromatografía líquida existe una fase móvil y una fase estacionaria. Para esta última existen las columnas para cromatografía, y son las que alojan esta fase. Como con todo proceso, dependerá del tipo de separación que se quiera hacer y se pueden encontrar varios tipos:
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Las columnas más utilizadas son las columnas de fase reversa, en las cuales la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil. Son ideales para separar compuestos polares, como los ácidos orgánicos o los azúcares.
Las columnas de fase normal donde la fase estacionaria es más polar que la fase móvil. Útiles para separar compuestos no polares.
También es posible encontrar las columnas de interacción iónica, utilizadas cuando los compuestos tienen cargas y es posible separarlos por interacciones electrostáticas.
Estos son sólo ejemplos de las columnas más utilizadas, pero puedes revisar otro tipo de columnas según tu necesidad.
Ojos sobre la muestra: Los detectores
Como lo indica ya la palabra, los detectores son los que “detectan” o, dicho de otra forma, los que nos informan qué es lo que hay y en qué cantidad en la muestra analizada. Identificar y cuantificar es la tarea de los detectores y, como todas las muestras son distintas, hay detectores para cada ocasión:
El detector de índice de refracción (RID) mide los cambios en el índice de refracción de la fase móvil cuando pasa por un componente. Se puede utilizar sobre compuestos que no absorben la luz UV como los carbohidratos.
Si el compuesto absorbe luz ultravioleta o visible, el detector más apropiado es el detector UV-VIS. Son muy comunes por su sensibilidad y variedad de aplicaciones, como en fármacos o aditivos alimentarios.
Detector UVD 2.1L Knauer con rango de detección de 190 - 750 nm
Otro tipo de detector es el detector de fluorescencia (FLD). Es muy sensible y utilizado para determinación de compuestos con fluorescencia natural como micotoxinas, pesticidas, aminoácidos y compuestos bioactivos.
También es bastante utilizado el detector DAD o de arreglo de diodos, caracterizado por su capacidad para medir la absorbancia de una muestra a múltiples longitudes de onda simultáneamente, lo que permite la detección y cuantificación de compuestos en una mezcla compleja.
Detector Azura DAD 6.1L de Knauer con un rango de longitud de onda de 190 a 1000 nm.
Puedes encontrar otros tipos de detectores, pero estos son los más comunes, aunque cabe resaltar que, al igual que con las columnas, la elección entre uno u otro siempre depende del tipo de muestra.
Parámetros para tener en cuenta
Ya vimos a grandes rasgos cómo ocurre la separación de sustancias por medio de la técnica de la cromatografía líquida. Ahora, para el análisis es crucial, entre muchos otros, tener en cuenta los siguientes parámetros:
El tiempo de retención es el tiempo que un compuesto tarda en pasar por la columna. Cada sustancia tiene su propio tiempo de retención, lo cual ayuda a identificarla.
La capacidad de la técnica para separar compuestos que están muy cerca uno del otro es conocida como la resolución. Mejor resolución significa mejor separación.
Cuando se habla de la relación entre el tiempo que un componente pasa en la fase estacionaria y el tiempo que pasa en la fase móvil se habla del factor de capacidad. Un adecuado valor de este parámetro asegura una buena separación.
Otro parámetro importante es la eficiencia de la columna, el cual indica qué tan bien la columna puede separar los compuestos y se mide en términos de platos teóricos.
Esta es sólo una introducción de lo que es una poderosa herramienta en extremo útil y por esto ampliamente utilizada en controles de calidad para alimentos, medicamentos, análisis de aguas o investigación y desarrollo de productos químicos. Gracias a su sensibilidad y precisión, la cromatografía líquida continúa siendo una herramienta esencial para la ciencia y la industria moderna.
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